このスライドではクリスパーキャスナインによるゲノム編集の概要、
ならびにクリスパー技術を用いた遺伝子ノックアウトキットを
ご紹介致します。
遺伝子ノックアウトは、遺伝子機能解析を行うための一般的な
手法です。
この手法では、
細胞のゲノムDNAを修正することで対象遺伝子を
破壊します。
遺伝子ノックアウトにより生じる表現型は、
何れも、
破壊した遺伝子の機能を知る手がかりとなります。
従来型のノックアウト実験は、しばしば動物を用いて
行われていましたが、多大な時間、費用、
および労力を要するものでした。
そのため、
これらの実験は、
財源の豊富な研究室や、
中心的な施設に限定されるのが一般的で、
これは、遺伝子機能探索を行う研究者にとって、
非常に高い障壁となっていました。
クリスパー技術の急速な発展によって、この状況が変化し、
多くの研究室にとって遺伝子ノックアウトがより身近な、
そして、
手に届く実験手法となりました。
クリスパーによってもたらされた革命の最たるものとして、
配列特異的な、二本鎖切断の賛成が挙げられます。
クリスパーを用いることで、
理論的にはゲノム内の如何なるVにも、
二本鎖切断を作成できます。
クリスパーにより生じた、
二本鎖切断を修復する機序として、
主に2種類のものがよく知られており、これらは、
非相同性末端結合、
すなわち
「NH-EJ」と、
相同製組換えとしても知られる、
相同性配向型修復、
すなわち
「HDR」です。
非相同性末端結合では、
二本鎖切断の末端が、
単にお互い
「最結合」するため、
この工程で非常に誤りが起こりやすく、
「変異」「挿入」、
および欠損が生じた結果、遺伝子のKnockoutが起こります。
一方、
相同性配工型修復では、
組み込みたい配列の両末端に、
相同配列を付加した
「修復用鋳型」を利用します。
「相同性組換え」を介して、期待する変更配列が
ゲノムに組込まれます。
クリスパー、
ノックアウト、
ノックインキットは、相同性配工型修復システムを利用しています。
プラスミドを用いた、
HDRシステムでのノックアウト実験を計画する場合、
つぎの３つのコンストラクトが必要となります。
1つ目。
二本鎖切断を期待する
部位を標的とするガイドRNAをコードしたプラスミド。
2つ目。
「キャスナイン」タンパク質をコードしたプラスミド。
3つ目
組込みたい配列と、
その両末端に
切断部位と相同する両腕配列をもつ
修復鋳型として機能するプラスミド。
またはドナーベクター。
の３つです。
Origene社では、
ノックアウト実験がより簡単に進められるよう、
デザイン済みキットをご提供しています。
各遺伝子座位に対して、
特異的なキットを作製しており、
1つ目の二本鎖切断を期待する部位を標的する
ガイドRNAと、
2つ目の
「キャスナイン」タンパク質は、
１つのオールインワンベクターに組込まれています。
遺伝子コード配列の始めの部分を標的する
ガイドRNAベクターは、
「キャスナイン」タンパク質発現カセットをもつベクターに組み込まれています。
ドナーベクターには、選択した切断部位と相同する
両腕をもった、
ノックイン用「GFP」・
「ピューロマイシン」カセットが組み込まれています。
これによりノックアウト細胞を、
ピューロマイシンマーカーにより選択することができます。
プロモーターを持たないGFPを利用することで、
上流に存在する可能性のある
プロモーター活性をモニターすることもできます。
knockout実験を始める場合、
まずガイドRNAベクターと、ドナーDNAプラスミドを、
細胞に同時にtransfectionします。
「キャスナイン」タンパク質が、
開始コドン近傍の二本鎖を切断し、相同性組換えにより
標的遺伝子に置き換わって、
機能をもつカセットがゲノムに組み込まれます。
最終的に
つぎの３つの現象が生じます。
1つ目
遺伝子崩壊により、
標的遺伝子がノックアウトされます。
2つ目
内在製遺伝子の「プロモーター」に駆動されたGFPより、
プロモーター強度の追加情報が得られます。
3つ目
PGKプロモーターカのピューロマイシンマーカーがゲノムに組込まれ、
ゲノム編集が良好に行われた細胞の
「セレクション」が可能となります。
オリジン社、
ノックアウトキットのプロトコルは、
同時「トランスフェクションから」始まり、
２つのガイドRNAベクターのうちの１つと
ドナーベクター。
スクランブルコントロールと
ドナーベクター、
といった3種の独立した実験で構成されています。
ドナーベクター自体がピューロマイシン耐性を示すため、
トランスフェクション後、
ピューロマイシン選択前に、
細胞を20日間培養する必要があります。
「トランスフェクションした」細胞を20日間培養することで、
エピソームの
「ドナーベクター」を確実に消失させることができると考えられます。
この模式図に、
「トランスフェクションした」細胞へのピューロマイシンの添加と、セレクション前の
K-Die培養の詳細を示しました。
ヘック/kneeQ産サイボウの場合、
トランスフェクション後48時間は、
Gワン細胞と見なされ。
この段階で、細胞は1から10に分裂しますが、
さらに3日間培養を行います。
G2期に、
クリスパー標的切断と遺伝子編集が終了すると考えられますが、
編集済み細胞の割合はまだ低いと考えられます。
もちろん、
Gツー細胞を用いて
ゲノムDNA分析を行うこともできますが、
データが陰性であった場合は、
ピューロマイシン選択後に再度分析を行います。
Gセブン以降に、
使用細胞に適した濃度で
ピューロマイシン選択を行います。
ここで、クリスパー/ノックアウト/ノックイン/プロトコルを要約します。
ステップ1
ガイドRNAベクターとドナーベクター、
および適切なコントロールをそれぞれ同時トランスフェクションします。
ステップ2
「トランスフェクションした」細胞をおよそ20日間培養します。
ステップ3
ピューロマイシン選択を行い、
「単一細胞コロニー」を単離します。
薬剤セレクションに使用する投与量は、
各細胞株における死滅曲線により決定する必要がある
ことをご留意ください。
knockoutキットの/それぞれをトランスフェクションした/ヘック/
kneeQ産細胞において、
ピューロマイシン選択の5日後に、2つのコントロールトランスフェクション群の
細胞はほぼ全て死滅しました。
一方で、
ガイドRNA構築とドナーベクターを
「同時トランスフェクションした」細胞群では、
期待された通りにピューロマイシン耐性細胞が得られました。
4番目のステップは、
ピューロマイシン陽性細胞を分析して、
ノックアウトを検出することです。
標的タンパク質
特異的な抗体がある場合、
ウエスタンブロットでノックアウトの検証を行うことができます。
この方法は、
単一コロニーを単離した後で用いるとよいでしょう。
この他に、ゲノムPCRを行って、
ゲノムの期待する領域に、
GFP、
ピューロマイシンが組込まれたことを検証し、
引き続きシークエンシングによって、
ゲノムへの組込みを確認する方法があります。
編集された対立遺伝子のみを増幅するため、
つぎの法則でPCRプライマーを設計します。
1つ目
フォワードプライマーは、ドナーベクターの相同左腕の、
5末端より上流から設計します。
2つ目
リバースプライマーは、
GFP領域内より設計します。
こちらの例では、
プロトコルに準じて、ATGfive遺伝子
knockoutを構築しました。
ガイドRNA構築とドナーベクターを
「同時トランスフェクションした」細胞からは、期待する大きさの
ゲノムPCR産物が得られました。
一方で、
スクランブルコントロールを「トランスフェクションした」
細胞からは、
期待される大きさのゲノムPCR産物は得られませんでした。
このあとで、
PCRプライマーを用いてPCR産物の配列決定を行い、
正しい組込みが行われたことを確認しています。
フォワードプライマーを用いたシークエンシングデータでは、
ドナーベクターの相同左腕の5末端が、
正しく組込まれていることが示されました。
リバースシークエンシングプライマーでは、
GFP・ピューロマイシンカセットの正確な組込みが確認できました。
本来のATGfive遺伝子は、
GFPにより破壊されていました。
ORIGENE社では、
ヒトおよびマウス遺伝子を、
ゲノムワイドに網羅する、クリスパー/ノックアウト/ノックイン
キットをご提供しています。
このキットは、
実験に必要なものがひとつのキットに含まれており、
商品到着後すぐに、
ゲノム上のほぼ全ての遺伝子をノックアウトすることができ、
同時にGFPや
ピューロマイシンカセットをノックインすることができます。
遺伝子破壊の結果を研究できるばかりでなく、
プロモーター研究を同時に行うことも可能です。
また、ＧＦＰや
ピューロマイシン以外の蛍光タンパク質、
ルシフェラーゼ、
または異なる選択マーカーをもった機能カセットもご用意しています。
ご視聴いただき、
ありがとうございました。
より、詳しい情報は、
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