
English: 
I'm Dorothee Kern and today I want to expose you to the topic of protein dynamics in biology.
Protein motion, change of things over time, is a fundamental characteristic of biological
function and, actually, life.
Since I was an undergrad, my big vision has been to be able to watch proteins in
real time at atomic resolution, as I can show you right... now, over here, arriving at the
real time movie of, for instance, an enzyme doing catalysis.
But why should you care about protein dynamics?
Let me use a macroscopic analogy to illustrate to you why we have to go beyond static snap...
snapshots to understand biological function.

Portuguese: 
Sou Dorothee Kern e hoje gostaria de falar sobre o tópico da dinâmica das proteínas em biologia.
O movimento das proteínas, a mudança das coisas ao longo do tempo, é uma característica fundamental da
função biológica  e, na verdade, da vida.
Desde que eu era estudante de graduação, meu grande objetivo era poder observar proteínas em
tempo real em resolução atômica, como posso mostrar agora ... agora, aqui, chegando ao
filme em tempo real de, por exemplo, uma enzima fazendo catálise.
Mas por que você deveria se preocupar com a dinâmica das proteínas?
Deixe-me usar uma analogia macroscópica para ilustrar a você por que temos que ir além da imagem estática ...
para entendermos a função biológica.

Portuguese: 
A partir desta pequena foto aqui, você não entende o meu jogo.
Então, você não sabe se a bola entra.
Mas, macroscopicamente, assistir a uma atividade é muito simples - é só comprar uma câmera de vídeo.
No entanto, é claro que isso não é possível em um nível microscópico.
De fato, o que quero dizer é que a dinâmica das proteínas macroscópicas está realmente enraizada na
dança microscópica de pequenos átomos.
E o que eu gostaria de fazer hoje é mostrar como a dinâmica das proteínas está ligada a
função biológica e com quais técnicas biofísicas - as técnicas biofísicas mais importantes -
você pode usar para visualizá-la.
Se você continua se perguntando, como as proteínas são funcionais, você atinge o nível de resolução atômica,
os menores blocos de construção da biologia.
A biologia estrutural revolucionou a nossa compreensão das proteínas nesse nível atômico.

English: 
From this little picture here, you don't know my game.
So, you don't know whether the ball goes in.
But, macroscopically, to watch action is very simple -- you just buy a video camera.
However, that's of course not possible on a microscopic level.
In fact, what I want to tell you is that macroscopic protein dynamics is actually rooted in the
microscopic dancing of individual little atoms.
And what I would like to do today is show you how protein dynamics is linked to
biological function, and which biophysical techniques -- the most prominent biophysical techniques --
you can use to visualize it.
If you keep asking the question, how do proteins work?, you arrive at the atomic resolution level,
the smallest building blocks of biology.
Structural biology has revolutionized our understanding of proteins on this atomic level.

Portuguese: 
No entanto, eu diria que essas belas estruturas que mostro não lhe dirão
como elas trabalham.
O que meu laboratório fez nos últimos anos foi adicionar uma outra porta à biologia estrutural
para vizualizar diretamente as proteínas em ação.
Então, eu  mostrei uma pequena visão geral do tipo de trabalho que nós... Nós temos desenvolvido.
Por exemplo, no primeiro, ali, você vê uma proteína de sinalização.
E, ao contrário da imagem do livro didático em que você pensa, que a proteína está no estado inativo
e, por exemplo, é fosforilada e passa para uma estrutura ativa,
o que descobrimos é que, na verdade, a proteína está constantemente
se movimentando para frente e para trás, variando entre
os dois estados, e portanto essa é uma imagem real de como a sinalização realmente funciona.
Na parte inferior, posso mostrar outro exemplo, como ... Como nós visualizamos como um

English: 
However, I would argue that these beautiful structures I show you will not tell you
how they work.
What my lab has done in the last years is to add the fourth dimension to structure biology
to directly watch proteins in action.
So, I just showed you a little overview, here, of the kind of work we are... we have worked on.
For instance, on the first one, over there, you actually see a signaling protein.
And unlike the textbook's picture that you think of, the protein is in the inactive state
and then it gets, for instance, phosphorylated and switches over to an active structure,
what we found is that, actually, the protein constantly flips back and forth, jumps between
the two states, and so it's a very different picture of how signaling actually works.
Down at the bottom, I can show you another example, how... how we visualized how a

Portuguese: 
transportador multidrogas transporta as drogas que você acabou de colocar na célula,
de dentro para fora, através de uma constante mudança conformacional.
Até perguntas envolvendo a neurobiologia, por exemplo, memória de longo prazo, que estou lhe mostrando ...
pode ser explicado pelas interações dinâmicas entre uma enzima que estamos
estudando e um receptor no cérebro.
Esta, por exemplo, foi uma história bastante interessante em que trabalhamos na dependência da cocaína
em ... em ratos.
No lado direito, você vê que, para interações proteína / proteína, é novamente ...
não é um encaixe rígido, mas as interações proteína / proteína são mediadas por uma interação dinâmica
entre os dois jogadores.
E até ... por fim, para o transporte de medicamentos, que era ... você sabe, o dogma é que é ...
essa molécula pequena apenas se liga a uma proteína e inibe, nós mostramos que o

English: 
multidrug transporter transports drugs which you just put in the cell,
from the inside back to the outside, via a constant conformational change.
Even questions like neurobiology, for instance, long-term memory, which I'm showing you...
show you over here, can be explained by the dynamic interactions between an enzyme we're
studying and a receptor in the brain.
This, for instance, was a quite interesting story where we worked on the cocaine dependence
on... on mice.
On the right side, over there, you see that for protein/protein interactions it's again...
it's not a rigid-body docking, but protein/protein interactions are mediated by a dynamic interplay
between the two players.
And even... lastly, for drug binding, which was... you know, the dogma has been that it's...
this small molecule just docks onto a protein and inhibits, we have shown that the

Portuguese: 
componente crucial para o design racional de medicamentos é, na verdade, a dinâmica das proteínas.
Então, depois de provavelmente te deixar tonto ... assistindo todos esses filmes, é melhor
eu contar a vocês como estamos realmente chegando a eles ... nesses filmes quadridimensionais.
Eu mostro aqui uma coleção de métodos biofísicos que nos permitem ver o invisível.
E eu o chamo de invisível, porque é claro que você não pode observar átomos individuais sob um microscópio,
se movendo em tempo real ... nas diferentes escalas de tempo.
Vou mencionar alguns desses métodos na minha palestra.
O que eu mostro, por exemplo, é a espectroscopia de RMN, que significa ressonância magnética nuclear,
que é o nosso método mais simples, e eu diria que um dos melhores métodos para medir
movimentos em resolução atômica.
Nós combinamos isso com espectrometria de massa, cristalografia de raios X, recentemente ...
experimentos cinéticos tradicionais, por exemplo, experimentos de fluxo interrompido e fluxo extinto,

English: 
crucial component for rational drug design is actually protein dynamics.
So, after I made you probably already dizzy looking... watching all these movies, I better
tell you how we're actually arriving at these... at these four-dimensional movies.
I show you here a collection of biophysical methods which allow us to see the invisible.
And I call it invisible because of course you cannot watch single atoms under a microscope,
for sure not dancing in real time on... on their different timescales.
So, I will mention some of those methods in my talk.
What I show you, for instance, is NMR spectroscopy, which stands for nuclear magnetic resonance,
which is our bread and butter method, and I would argue one of the best methods to measure
motions on an atomic resolution.
We combine that with mass spectrometry, X-ray crystallography, very now...
old-fashioned kinetic experiments, for instance, stopped-flow and quenched-flow experiments,

English: 
and... or single-molecule fluorescence and energy transfer experiments.
Very lately, we also have been using bioinformatics, which I show you down on the bottom, for analyzing
the evolution of protein function.
And finally, all these experimental methods are being combined with computation,
which of course plays a very big role to finally come up with our dancing molecules.
These dancing molecules are fun to watch, but we have to find a unifying language to
describe our biophysical systems, in this case, our proteins.
And the unifying language which is unambiguous, whether you are living in India or China or
America or Australia, is actually the free energy landscape.
I'm sure you've heard about it.
The free energy of the systems.

Portuguese: 
e ... ou experimentos de fluorescência de molécula única e transferência de energia.
Ultimamente, também usamos bioinformática, que mostro aqui em baixo, para analisar
a evolução da função das proteínas.
E, finalmente, todos esses métodos experimentais estão sendo combinados com computação,
que obviamente desempenha um papel muito importante para finalmente criar nossas moléculas dançantes.
Essas moléculas dançantes são divertidas de assistir, mas temos que encontrar uma linguagem unificadora para
descrever nossos sistemas biofísicos, neste caso, nossas proteínas.
E a linguagem unificadora que não é ambígua, se você mora na Índia ou na China ou
América ou Austrália, é realmente superfície de energia livre.
Tenho certeza que você já ouviu falar sobre isso.
A energia livre dos sistemas.

English: 
And so what I show you here is probably one of the key things for the lecture.
And why you actually want to pay attention in your classes to physical chemistry.
If you have a protein which, for instance, interconverts between two different states,
for instance, state A and state B, which could be the inactive and active states, to describe
the entire system we want to do three things.
We want to figure out the populations between the states, and so what you see actually...
that, of course, in the energy landscape, a state is defined as a minimum in the
free energy landscape, over here and over there.
The interconversion, meaning going from state A to state B,
is going over the transition state.
So, in the energy landscape, the transition state is defined as this saddle point and
the high point of the free energy landscape.
So, what I described right now are the two major states.

Portuguese: 
E o que eu mostro aqui é provavelmente um dos principais pontos da palestra.
E porque você realmente deve prestar atenção em suas aulas de físico-química.
Se você possui uma proteína que, por exemplo, oscila entre dois estados diferentes,
por exemplo, o estado A e o estado B, que podem ser os estados inativos e ativos, para descrever
o sistema, nós temos que fazer três coisas.
Nós temos que descobrir as populações entre os estados, e o que você vê na verdade …
que, é claro, uma superfície energética, um estado definido como mínimo na
superfície de energia livre, aqui e ali.
A interconversão, que significa ir do estado A ao estado B,
está passando pelo estado de transição.
Portanto, na superfície de energia, o estado de transição é definido como esse ponto de selao e
o ponto máximo da supeficie de energia livre.
Então, o que descrevi agora são os dois principais estados.

Portuguese: 
Nós os chamamos de estados cineticamente distintos porque são separados por uma grande barreira de
energia livre.
E como você sabe, existe ... a altura da barreira de energia livre que define
a taxa de interconversão.
Barreira elevada significa lenta.
Barreira pequena significa rápido.
Então, quando passamos do nível 0 para o nível 1, é claro que também temos ...
temos na verdade barreiras menores, o que significa que essas interconversões
são mais rápidas, por exemplo, na escala de tempo em nanossegundos.
Nós os chamamos de camada 1.
E ainda mais abaixo, temos mais microestados, que podem ser centenas de milhares
dentro desse estado A, que estão se convertendo na escala de tempo de picossegundo.
E nós os chamamos de subestados entrópicos.
E, finalmente, se você deseja realmente descrever completamente os sistemas, nós precisamos  conhecer
as estruturas de todos esses momentos instantâneos e estruturas que estão sendo mostradas.
Então, esse é realmente o objetivo geral, porque se você pode descrevê-lo ... nosso sistema dessa maneira,
nós o entendemos completamente.

English: 
We call them kinetically distinct states because they are separated by a pretty big free energy
barrier.
And as you know, there's... the height of the free energy barrier that defines
the rate of interconversion.
Big barrier means slow.
Little barrier means fast.
So, when we go down from the tier 0 to tier 1, we of course also have smaller...
over there, we have actually smaller... smaller barriers, meaning that these interconversions
are faster, for instance, on the nanosecond timescale.
We call them tier 1.
And even further down we have more microstates, which could be hundreds of thousands
within that A state, which are interconverting in the picosecond timescale.
And we call them entropic substates.
And finally, if you want to really completely describe the systems, we would like to know
the structures of all these snapshots, and structures which are being sampled.
So, that's really the big picture goal, because if you can describe it... our system in this way,
we fully have understood it.

Portuguese: 
Agora, que tipo de movimento pertence a essas escalas de tempo de picossegundo / nanossegundo / [microssegundo]?
As escalas de tempo muito rápidas, se você aprendeu com ... em química, são na verdade vibrações nas ligações.
Passando de femtossegundos para picossegundos para nanossegundos, passamos a rotações nas
ligações simples, movimentos de loop e rotações da cadeia lateral.
E finalmente, chegando a milissegundos, segundos ou talvez até horas,
estamos falando de movimentos muito coletivos de muitos átomos juntos.
A última pergunta, agora, é: que tipo de métodos poderiam ser usados?
Então, eu identifiquei alguns métodos, que você pode ver são usados ​​para descrever diferentes escalas de tempo
dos movimentos, aqui.
E isso será, agora, parte da conversa, para explicar como usar esses métodos para
descobrir os movimentos nessas diferentes escalas de tempo.
Para restante da palestra, para ser realmente, realmente, prática, eu escolhi

English: 
Now, what kind of motions belong to these picosecond/nanosecond/[microsecond] timescales?
The very fast timescales, if you have learned from... in chemistry, are really bond vibrations.
Moving up from femtoseconds to picoseconds to nanoseconds, we go into rotations of
single bonds, loop motions, and sidechain rotations.
And then finally, going all the way up to milliseconds, seconds, or maybe even hours,
we are talking about very collective motions of many atoms together.
The last question, now, is, what kind of methods could be used?
So, I've pinpointed a few methods, which you can see are used to describe different timescales
of motions, over here.
And this will be, now, part of the talk, to explain to you how to use these methods to
figure out motions on these different timescales.
For the remainder of the talk, in order to be actually, really, like, hands-on, I'm choosing

English: 
to describe how to study protein motions and how the motions are dictating biological function
on one system, which is the catalytic power of enzymes during catalysis.
It has always intrigued me how amazing enzymes are in their catalytic power.
This enzyme, for instance, is an absolutely essential enzyme in every cell in every organism
because it contr... it catalyzes the interconversion between ATP and AMP to ADP molecules.
So, why is this reaction so essential for every cell?
It contains... it maintains the right nucleotide concentrations in the cell.
You might not know, but if your ATP concentration in the cell drops below 1 millimolar,
you're dead.
So, this reaction, without the enzyme, would take 7000 years.
The enzyme can complete this chemical reaction within 10 milliseconds.
So, that's sort of, really, the fascinating power of enzymes.

Portuguese: 
descrever como estudar os movimentos das proteínas e como esses movimentos ditam a sua função biológica
um sistema, que é o poder catalítico das enzimas durante a catálise.
Sempre me intrigou como as enzimas são surpreendentes em seu poder catalítico.
Essa enzima, por exemplo, é uma enzima absolutamente essencial em todas as células de todos organismos
porque controla ... catalisa a interconversão entre moléculas de ATP e AMP em ADP.
Então, por que essa reação é tão essencial para todas as células?
Ela. mantém as concentrações corretas de nucleotídeos na célula.
Talvez você não saiba, mas se a concentração de ATP na célula cair para valores abaixo de 1 milimolar,
você está morto.
Então, essa reação, sem a enzima, levaria 7.000 anos.
A enzima pode concluir esta reação química em 10 milissegundos.
Então, esse é realmente o poder fascinante das enzimas.

Portuguese: 
E estamos longe de entender como essas proteínas sofisticadas podem fazer isso.
Então, agora, o que os cientistas fizeram até o momento?
A maneira tradicional de descrever o poder enzimático é usar, na verdade, números de coversão
- quão rápido a enzima está convertendo um substrato - com por exemplo, na constante de Michaelis-Menten,
que é, aproximadamente, a afinidade da proteína e do substrato.
O que eu queria fazer - e isso era meio que o meu sonho, desde que eu era estudante de graduação -
era assistir a enzima em ação em resolução atômica, meio que como mostrado com aquele pequeno
borrão de ... de ... de ... da imagem, aqui.
Então, como chegamos lá?
Eu disse a você o próximo passo que tínhamos que dar era entender a superfície de energia livre.
Antes de fazermos isso, é claro que eu disse, precisamos descrever todos os estados.
Para descobrir quais estados são realmente amostrados durante a catálise, uma etapa muito importante
é  apartir de uma  enzima, relamente  montar o esquema da reação.

English: 
And we are far away from understanding how these sophisticated proteins can do it.
So, now, what have scientists done so far?
The traditional way of describing enzymatic powers is using, actually, turnover numbers
-- how fast the enzyme is turning over a substrate -- or, for instance, a Michaelis-Menten constant,
which is really the, sort of, affinity of the protein and the substrate.
What I wanted to do -- and that was sort of my, you know, dream since I was an undergrad --
was to watch the enzyme in action at atomic resolution, sort of shown with that little
blur of... of... of... of the picture, here.
So, how do we get there?
I told you the very next step is that we have to figure out the free energy landscape.
Before we do that, of course I told you, we have to describe all states.
In order to figure out which states are actually sampled during catalysis, a very important step
is to come from an enzyme to actually putting in the scheme of the reaction.

English: 
And for the scheme, I mean to write down every single state we can imagine the enzyme is
sampling.
So, what do you see over here, the enzyme, the free enzyme over there, can combine substrates.
It has to bind, actually, two substrates, ATP and AMP, to make the ternary complex.
Then this enzyme can do conformational change.
Then chemistry happens.
Then another conformational change.
And then, finally, substrates have to be released.
So already, on this, you know, only 20 kiloDalton protein, it's going to sample at least 10
microscopic steps.
Now, from this scheme, we would finally... we'd want to actually arrive at figuring out
the relative populations and the conversion rates of structures,
which would be the free energy landscape.
The first method I want to introduce is NMR spectroscopy, not only because it's

Portuguese: 
E nesse esquema, quero descrever todos os estados individuais que  imaginamos que a enzima possa
experimentar.
Então, o que você vê aqui, a enzima, a enzima livre ali, pode combinar substratos.
Ele tem que ligar, na verdade, dois substratos, ATP e AMP, para formar o complexo ternário.
Então essa enzima pode fazer alterações conformacionais.
Então a química acontece.
Em seguida, outra mudança conformacional.
E, finalmente, os substratos precisam ser liberados.
Então, com isso, você sabe, uma proteína de apenas 20 KDa,  vai passar por pelo menos 10
etapas microscópicas.
Agora, com esse esquema, nós finalmente ... nós gostaríamos de realmente descobrir
as populações relativas e as taxas de conversão das estruturas,
que seria a superfície de energia livre.
O primeiro método que quero introduzir é a espectroscopia de RMN, não apenas porque está

English: 
close to my heart, because... but I think it is really the unique method to watch every single atom
in the protein doing its function, dancing.
And the reason is because we can figure out the entire time range of motions from picoseconds
all the way to hours by just choosing the right methods -- down, over here --
in our NMR toolbox.
I told you we can measure sing...
every single atom in a protein.
Another unique thing is that we actually can measure things at equilibrium.
So, in many other spectroscopic methods, you have to disturb the equilibrium and you're
watching how you're re-equilibrating, versus in NMR you can actually measure the equilibrium.
And most importantly, I would say, we can measure under physiological conditions.
We can change temperature, pH, the substrate concentration.
We are in solution and having our protein doing what's... what it wants to do and, while
it's doing its function, watching.
So, this is sort of why I really think that it is a very powerful method for protein dynamics.

Portuguese: 
gosto dela, mas porque ... mas acho que é realmente o único método para observar todos os átomos
da proteína fazendo sua função, dançando.
E o motivo é que podemos descobrir todo o intervalo de movimentos dos picossegundos
até horas, apenas escolhendo os métodos certos - aqui embaixo -
em nossa caixa de ferramentas de RMN.
Eu disse que podemos medir um único ...
cada átomo de uma proteína.
Outra coisa especial é que realmente podemos medir as coisas em equilíbrio.
Então, em muitos outros métodos espectroscópicos, você precisa perturbar o equilíbrio e
observar como está se reequilibrando, enquanto na RMN você pode realmente medir o equilíbrio.
E o mais importante, eu diria, podemos medir em condições fisiológicas.
Podemos alterar a temperatura, o pH, a concentração do substrato.
Estamos em solução e temos nossa proteína fazendo o que ... o que ela quer fazer e, enquanto
está fazendo sua função, observando.
Então, é por isso que eu realmente acho que esse é um método muito poderoso para estudar a dinâmica das proteínas.

Portuguese: 
Então, qual é a física por trás disso?
Pensei em compará-la com um método, que tenho certeza de que todo mundo já conhece,
que é a ressonância magnética que você faz se tiver, por exemplo, uma lesão,
todo o seu corpo é empurrado para um grande ímã para ver que tipo de lesão, por exemplo,
você tem no… no  joelho.
Então, é um método de imagem.
Acontece que usamos exatamente o mesmo método para ressonância magnética nuclear, exceto que
não colocamos um corpo inteiro lá para criar imagens de tecidos, mas nossas proteínas individuais
que realmente queremos assistir ... assistir ou olhar para cada átomo.
Portanto, a frequência de excitação está nos comprimentos de onda do rádio, o que significa que você pode realmente
ouvir a excitação de átomos individuais, que mostrarei agora.

English: 
So, what's the physics behind it?
I thought of comparing it to a method, which I'm sure everybody has encountered already,
which is magnetic resonance imaging, where, if you have, for instance, an injury,
your whole body gets pushed into a big magnet to see what kind of injury, for instance,
you have on the... on the... on the knee.
So, it's an imaging method.
It turns out we use exactly the same method for nuclear magnetic resonance, except that
we don't put a whole body in there to image tissue, but rather our individual proteins
that we want to actually watch... watch, or look at every single atom.
So, the frequency of excitation is in the radio wavelengths, which means you can actually
listen to the excitation of the individual atoms, which I'll show you right now.

English: 
So, what you just heard was actually the free induction decay, the release of the...
of the wavelength energies on the radio wave of a single atom.
But, of course, a protein, over here, consists of thousands of atoms.
And we would like to watch or listen to every single atom.
So, for that, we can actually excite all atoms in this protein and record their frequencies,
which are different.
For instance, here I show you a proton-nit... a proton-nitrogen correlated spectrum.
So, each point over here belongs to one amide in your protein.
It's a signature which has a unique frequency.
So, now we can listen to the entire protein resonating, which I'll play right now.
Does it sound just like a song?
So, this is some of the physics behind, right?, to figure out at which frequencies it resonates.

Portuguese: 
Então, o que você acabou de ouvir foi, na verdade, o decaimento de indução livre, a emissão da ...
da energia contida no comprimento de onda das ondas de rádio de um único átomo.
Mas, é claro, uma proteína, como essa, consiste em milhares de átomos.
E gostaríamos de assistir ou ouvir todos os átomos.
Então, para isso, podemos realmente excitar todos os átomos dessa proteína e registrar suas frequências,
que são diferentes.
Por exemplo, aqui eu mostro a você um espectro de próton-nit ... um espectro que correlaciona próton-nitrogênio.
Então, cada ponto aqui pertence a uma amida da sua proteína.
É uma assinatura que possui uma frequência única.
Então, agora podemos ouvir toda a proteína ressonante, que tocarei agora.
Soa como uma música?
Então, isso é parte da física por trás, certo ?, para descobrir em que frequências ele ressoa.

Portuguese: 
Mas agora você quer descobrir com que rapidez eles dançam.
Então, temos que fazer mais um truque para nossos spins, ou nossos núcleos.
Então, o que vamos fazer é registrar o relaxamento desses spins de
um estado excitado.
E eu decidi, novamente, colocar alguns desenhos em cima, aqui, para os biólogos e depois
algumas pequenas equações para a física, aqui embaixo.
Então, vamos comparar nossos spins com os corredores.
Se nós realmente os colocamos no estado excitado, o que realmente fazemos...nós os colocamos
no ponto inicial da linha de partida e eles estão todos juntos começando, movendo-se entorno
de seus próprios estados ... nessas ... nessas frequências que você acabou de ouvir.
Eles estão juntos, então estão em ressonância - é assim que você chama isso em física.
Mas o tempo todo, alguns correm mais rápido e outros mais lentos.
E essa defasagem no nosso  estágio, nós chamamos de relaxamento transversal.
E a velocidade desse relaxamento nos diz diretamente sobre a velocidade com que essas proteínas se movem.

English: 
But now you want to figure out how fast they dance.
So, we have to do one more trick to our spins, or our nuclei.
So, what we're going to do is we're going to record the relaxation of these spins from
an excited state.
And I decided, again, to put some cartoons on top, here, for the biologists and then
some little equations for the physics, down here.
So, let's compare our spins with runners.
If we actually put them in the excited state, what we actually do... we put them on the
stadium at the starting line and they are all together starting, running around the
stadium in their... these... these frequencies you just heart.
They're together, so they are on resonance -- that's how you call it in physics.
But all the time, some will run faster and some will run slower.
And it's this dephasing in our stadium which we call transverse relaxation.
And the speed of this relaxation directly tells us about how fast these proteins move.

English: 
And I've shown you, of course, that these are single exponential decays for the people
who like, actually, physics.
And so we can measure that.
One more thing we have to do to our runners, we don't just want to say, okay, these atoms
are moving.
We actually want to describe our free energy landscape.
Remember, what we... what our goal was, to figure out the relative populations,
the rate of interconversions, and give structural information.
And very, very exciting, the Palmer lab, now... oop, almost 20 years ago, figured out
one more trick we can do to our runners.
I told you they are running with different speeds.
If we now, during this relaxation time, flip the runners, so that Bolt, who was the fastest,
will be last, and the one who was last will be fast... will be the fastest,
they will actually finish in the stadium at the same time.
And what we call that in physics, we are refocusing our pulses.
And it's this extra trick, where we actually refocus our... our relaxation in the XY plane,

Portuguese: 
E o que mostrei a você, é claro, é o decaimentos exponencial individual, como dizem as pessoas
que gostam de física.
E assim podemos medir isso.
Mas tem mais uma coisa queremos  fazer com nossos corredores, não queremos apenas dizer, ok, esses átomos
estão se movendo.
Na verdade, queremos descrever nossa superfície de energia livre.
Lembre-se, o que nós ... qual era o nosso objetivo, descobrir as populações relativas,
a taxa de interconversões e fornecer informações estruturais.
E muito, muito empolgante, o laboratório Palmer, agora ... ops, há quase 20 anos atrás, descobriu
mais um truque que podemos fazer com nossos corredores.
Eu disse que eles estão correndo com velocidades diferentes.
Se agora, durante esse tempo de relaxamento,
invertermos a posição dos corredores, para que Bolt, que foi o mais rápido,
seja o último, e quem foi o último, seja rápido ... seja o mais rápido,
eles realmente chegarão ao estádio ao mesmo tempo.
E o como chamamos na física, estamos reorientando nossos pulsos.
E é esse truque extra, onde na verdade reorientamos nosso ... nosso relaxamento no plano XY,

Portuguese: 
que nos permite obter tudo isso ... todas as informações que precisamos sobre a escala de tempo,
as populações e a informações estrutural.
Tudo bem.
Acho que sobrecarregei você  um pouco de mais com RMN, mas é que eu
fico empolgada com isso.
Vamos ver alguns dados agora.
Meus pós-docs, Magnus e Vu, fizeram esses experimentos com essa enzima durante a catálise.
Eu disse que podemos observar a enzima durante a catálise.
Então, colocamos nossa enzima num tubo de RMN.
E assim que adicionamos substrato, ela realmente catalisa essa reação.
E acontece que, por ser uma reação totalmente reversível, fará isso para sempre.
Temos amostras que estão girando nesse ciclo enzimático há dois meses
E enquanto ... enquanto está fazendo seu trabalho, podemos medir esses tempos de relaxamento e, portanto,
obter informações sobre a dinâmica das proteínas.
Encontramos um resultado muito emocionante.
O que eu mostro aqui é que todos esses resíduos vermelhos, por aqui, na verdade parecem

English: 
which allows us to get all these... all the information we need about the timescales,
the populations, and structural information.
Alright.
I think I have overloaded you, maybe, with a little bit too much NMR, but I just
get excited about it.
Let's look at some data now.
My postdocs, Magnus and Vu, did these experiments on this enzyme during catalysis.
I told you we can watch the enzyme during catalysis.
So, we are putting our enzyme in the NMR tube.
And as soon as we add substrate, it actually catalyzes this reaction.
And it turns out, because it's a fully reversible reaction, it's going to do this forever.
We have samples which have been running through this enzymatic cycle for two months.
And while... while it's doing its job, we can measure these relaxation times, and therefore
get information about protein dynamics.
We found a very exciting result.
What I show you here is that all these red residues, over here, actually seem to be

English: 
moving around during catalysis.
And what we found is that what we are actually detecting is the opening and closing of
this protein, which I show you, here, in the open state and, here, the closed state.
And it turns out that this opening and closing... the closing is very fast,
the opening is way slower.
The opening is 40 per second.
If we now compare that rate constant with how fast this enzyme makes ATP, it's actually
within experimental error.
So, what we learned was our first surprise.
The rate-limiting step, the highest barrier in the energy landscape, is actually
not the chemical step of breaking a phosphate and putting it over there, but rather a large
conformational change of opening and closing.
And it turns out that this actually seems to be a reoccurring theme in biology,
that very often the limiting step in biology is actually how fast these enzymes or proteins
can dance.

Portuguese: 
mover-se durante a catálise.
E o que descobrimos é que o que realmente estamos detectando é a abertura e fechamento
dessa proteína, que eu mostro aqui, no estado aberto e, aqui, no estado fechado.
E acontece que essa abertura e fechamento ... o fechamento é muito rápido,
a abertura é bem mais lenta.
A abertura é 40 por segundo.
Se agora compararmos essa taxa constante com a rapidez com que essa enzima produz ATP, fica realmente
dentro do erro experimental.
Então, o que aprendemos foi a nossa primeira surpresa.
A etapa limitante para a taxa, a barreira mais alta na superfície energética, na verdade
não é a reação química da quebra do fosfato e ligá-lo ali, mas sim a grande
mudança conformacional de abertura e fechamento.
E acontece que, na verdade, esse parece ser um tema recorrente na biologia,
que muitas vezes o passo limitante do processo biológico é a rapidez com que essas enzimas ou proteínas
podem dançar.

English: 
But the whole point of this enzyme is not to dance around, but to actually make that
chemistry, right?
This is what classic enzymology is focusing on.
How can the pro... can the protein take ATP and AMP to make two ADP molecules?
So, break a phosphoanhydride bond and make a new one, right?
So, here we have the two ADP molecules.
The reason it's hard to measure is because it's not the rate-limiting step.
And, not the rate-limiting step, it's basically hard... hard to visualize because it's too fast.
So, the way we went around it is we used a different method, X-ray crystallography.
So, you could argue, crystallography, you're freezing the crystal, it's a static mech...
method.
However, we recorded the crystal... many crystallographic data at room temperature.
And it turns out that, at room temperature, things are still moving in the crystal.
And what I've shown you over here is two ADP molecules in the active site.
One is color... very much colored, because this smells like it's a dynamic molecule.

Portuguese: 
Mas o objetivo dessa enzima não é ficar dançando, mas fazer a
química, certo?
É nisso que a enzimologia clássica está se concentrando.
Como a proteína pode ligar ATP e AMP para formar duas moléculas de ADP?
Então, quebre uma ligação de fosfoanidrido e faça uma nova, certo?
Então, aqui temos as duas moléculas de ADP.
A razão pela qual é difícil de medir é porque essa não é a etapa limitante para a atividade.
E, por não ser uma etapa limitante, é basicamente difícil ... difícil de visualizar porque é muito rápido.
Então, a maneira como contornamos isso é usar um método diferente, a cristalografia de raios-X.
Então, você poderia argumentar, que na cristalografia, você está congelando o cristal, é um mecanismo estático ...
um método estático
No entanto, nós obtivemos o cristal ... muitos dados cristalográficos à temperatura ambiente.
E acontece que, à temperatura ambiente, as coisas ainda estão se movendo no cristal.
E o que eu mostrei aqui são duas moléculas de ADP no sÍtio ativo.
Uma é a cor ... muito colorida, porque essa é uma molécula dinâmica.

English: 
You see the speed of the phosphate?
Superimposing all of our crystal structures, it looks like... that this beta phosphate
is one which wants to fly over to make ATP.
Coinciding with this flexibility which we see in the active site is this arginine,
which seems to grab the negatively charged phosphate to move it over.
So, even though crystallography has a reputation as a static method, we actually can get quite
a lot of dynamic information.
So, this state over here is actually our enzyme-substrate complex.
Now, of course, you would like to know how it's actually doing the reaction to go over
the transition state.
The transition state is not populated, because it's on the top of the energy landscape.
So, the very next thing we can do is to try to mimic it with a transition state analog,
which I'm showing you over here.
So, an ADP molecule, a magnesium/aluminum fluoride, and an AMP molecule is mimicking

Portuguese: 
Você vê a velocidade do fosfato?
Sobrepondo todas as nossas estruturas cristalográficas, parece que ... esse beta fosfato
é aquele que quer sair voando para fazer ATP.
Coincidindo com essa flexibilidade que vemos no sítio ativo está a arginina,
que parece pegar o fosfato carregado negativamente para movê-lo.
Então, embora a cristalografia tenha uma reputação de ser um método estático, na verdade podemos obter
muita informação dinâmica.
Então, esse estado aqui é realmente o nosso complexo enzima-substrato.
Agora, é claro, você gostaria de saber como o complexo faz para passar do
o estado de transição.
O estado de transição não é populado, porque está no topo da superfície de energia.
Então, a o que podemos fazer é tentar simulá-lo com um análogo de estado de transição,
que estou mostrando aqui.
Então, uma molécula ADP, um fluoreto de magnésio / alumínio e uma molécula AMP estão mimetizando

Portuguese: 
exatamente quando este beta-fosfato está tentando passar de um ... uma etapa para a outra.
E então Young-Jin finalmente conseguiu obter essa estrutura cristalográfica de alta resolução.
E o que você vê é que o fluoreto de magnésio / alumínio, que mimietiza o fosfato no
estado de transição, está diretamente no meio entre o doador e o receptor.
Então, isso nos dá imagens instantâneas, mas ainda não é dinâmica.
Deixe-me apresentar um método diferente, que nos dará mais informações sobre dinâmica.
Então, isso é transferência de energia de fluorescência de molécula única com resolução temporal.
Foi uma colaboração muito divertida com meu irmão mais novo, Christian, e sua aluna de pós-graduação, Maria,
e meu pós-doutorado, Kathi.
E é sempre bom ter um irmão mais brilhante na ... na família.
Então, eu liguei para meu irmão, eu disse, você sabe, nós queremos medir essa proteína enquanto  ela faz
sua reação, e isso é um evento raro, então preciso da sua ajuda.

English: 
right when this beta phosphate is trying to fly from one... one step to the other.
And so Young-Jin finally succeeded to get this high-resolution crystal structure.
And what you see is that the magnesium/aluminum fluoride, which mimics the phosphate in the
transition state, is directly in the middle between the donor and acceptor.
So, this gives us snapshots but still not dynamics.
Let me introduce you to a different method, which will give us more dynamic information.
So, that is time resolved single molecule fluorescence energy transfer.
It was a very fun collaboration with my little brother, Christian, and his grad student, Maria,
and my postdoc, Kathi.
And it's always good to have a more brilliant brother in the... in the family.
So, I called my brother, I said, you know, we have to measure this protein while doing
its reaction, and it's a rare event, so I need your help.

English: 
And so the idea of a single molecule fluorescence energy transfer experiment is it's like a
spectroscopic ruler.
You're exciting the fluorescence donor, and this energy gets transferred to the acceptor
only when the two, donor and acceptor, are very close.
So, it's a directly spectroscopic ruler.
So, if we excite the green dye and we get a lot of fluorescence on the red one,
we know they are close together, whereas if you get very little over here they're further away.
So, we can do that on a single molecule level.
We can attach, right over here, a single enzyme molecule on a cover slide, and watch in
real time the red and green fluorescence correlating.
So again, far away means...
I mean, if there's very little transfer they're far away.
And if they're close together, they're close... they are coming closer together.
So, this is the thought experiment.

Portuguese: 
Um experimento de transferência de energia de fluorescência de molécula única funciona como
uma régua espectroscópica.
Você está excitando o doador de fluorescência, e essa energia é transferida para o receptor
mas somente quando os dois, doador e receptor, estão muito próximos.
Então, é praticamente uma régua espectroscópica.
Então, se excitarmos o corante verde e obtermos muita fluorescência no vermelho,
sabemos que eles estão próximos, enquanto que se vc conseguir muito pouco aqui, eles estão mais distantes.
Então, podemos fazer isso no nível individual de cada molécula.
Podemos prender, bem aqui, uma única molécula de enzima em uma lâmina e assistir
em tempo real, a fluorescência vermelha e verde se correlacionando.
Então, novamente, longe significa ...
Quero dizer, se houver muito pouca transferência, eles estão longe.
E se eles estão juntos, estão próximos ... eles estão se aproximando.
Então, este é o experimento que pensamos.

English: 
And now I'm showing you the real data.
And so here's where our next big surprise was found.
We measured first, actually, the enzyme, the happy enzyme in the presence of magnesium.
I for... sort of forgot to mention to you -- I showed you in the structure --
but it turns out magnesium is very essential for the catalysis for kinases.
And it was subscribed... described that magnesium is essential for that chemical step, the phosphotransfer,
right?, when the phosphate goes from one step to the other.
So... but here we are measuring the opening and closing of the enzyme, right?
So, if the fluorescent energy transfer is efficient, close to 1, over there,
we are in the closed state.
And if it's further away, we have very inefficient fluorescence transfer.
So, what you can see is that in real time, within milliseconds, this enzyme is opening
and closing.
But see what happens when you take the magnesium out.
We thought, if you take the magnesium out, only the chemical step, which is just the

Portuguese: 
E agora estou mostrando os dados reais.
E aqui é onde encontramos nossa próxima grande surpresa.
Medimos primeiro, na verdade, a enzima, a enzima feliz na presença de magnésio.
Eu ... esqueci de mencionar para vocês - eu mostrei na estrutura -
mas acontece que o magnésio é essencial para a catálise das quinases.
E foi descrito ... descrito que o magnésio é essencial para essa etapa química, a fosfotransferência,
certo ? Quando o fosfato passa de uma etapa para a outra.
Então ... mas aqui estamos medindo a abertura e o fechamento da enzima, certo?
Portanto, se a transferência de energia fluorescente for eficiente, perto de 1, ali,
estamos no estado fechado.
E se estiver mais longe, temos uma transferência de fluorescência muito ineficiente.
Então, o que você pode ver é que em tempo real, em milissegundos, essa enzima está se abrindo
e fechando.
Mas veja o que acontece quando você retira o magnésio.
Pensamos que, se você remove o magnésio, apenas a etapa química, que envolve o

English: 
movement of a phosphate by one Angstrom, is stopped.
But, in fact, it looks like now the opening and closing is slowed down by about
three orders of magnitude, because if you look at that timescale, over here, you're staying
in the closed state for several seconds.
How can that be?
Is the literature wrong?
So, since we were so puzzled about that result, that magnesium is actually very essential
for protein dynamics, we designed yet another method, an experiment which is based on
a new method, which I want to introduce now.
It's called quench-flow kinetics.
So, what we can measure is a single turnover of a protein, for instance, an enzyme,
in which it's doing its first turnover.
It's a fast mixing method, so we're using our enzyme over here, mix it with a...
with a substrate very quickly, and the reaction goes.
Then, in a second step, we can quench the reaction and then collect data to... a sample
for data analysis.
So, what does it allow us?

Portuguese: 
o movimento  do fosfato em apenas um Angstron seria paralizado.
Mas, o que ocorre de fato, parece que a abertura e o fechamento estão mais lentos
em três ordens de magnitude, porque, se você olhar para essa escala de tempo, aqui, você está
no estado fechado por vários segundos.
Como pode ser isso?
A literatura está errada?
Então, como estávamos tão intrigados com esse resultado, que o magnésio é muito essencial
para a dinâmica das proteínas, projetamos outro método, um experimento baseado em
um novo método, que quero introduzir agora.
É chamado de cinética de quench-flow.
Então, o que podemos medir é a conversão de uma proteína, por exemplo, uma enzima,
em que está realizando sua primeira reação.
É um método rápido de mistura, então estamos usando nossa enzima por aqui, misture-a com um ...
com um substrato muito rapidamente, e a reação começa.
Então, em uma segunda etapa, podemos extinguir a reação e coletar dados para ... Amostras
para análise de dados.
Então, o que isso nos permite?

Portuguese: 
Permite observar a fosfotransferência, na primeira conversão, e medir
essa etapa, mesmo que a etapa posterior possa ser mais lenta.
Então, poderíamos descobrir o quão é rápida é a transferência na primeira conversão.
Tudo bem.
Então, é isso que eu mostro a você, os dados que mostrarei a seguir.
E aqui estão as boas e as más notícias.
A boa notícia é que o experimento funcionou e a enzima é apagada rapidamente pela fosfotransferência.
A má notícia é que é muito rápido para ser acompanhado, porque o que você pode ver aqui,
dentro do tempo cego do experimento, cerca de 50 milissegundos, todas a enzimas converteram
ADP para ATP.
Portanto, nosso método é realmente tempo- limitado.
Então, em outras palavras, a natureza aperfeiçoou a etapa química para ser super rápida, ok?
E então o que você vê aqui são conversões múltiplas, agora.
Essa é a abertura lenta da enzima.

English: 
It allows us to look at the phosphotransfer, over here, in the first turnover, and measure
this step even though the later step might be slower.
So, we could figure out how fast this fast phosphotransfer is in the first turnover.
Alright.
So, this is what I show you, the data I show you next.
And here's the good and bad news.
The good news is the experiment worked and the enzyme is wicked fast for its phosphotransfer.
The bad news is it's too fast to be even caught, because what you can see over here,
within the dead time of the experiment, about 50 milliseconds, the entire enzyme has converted
ADP to ATP.
So, our method is actually time-limited.
So, in other words, nature has perfected the chemical step to be superfast, okay?
And then what you see over here are multiple turnovers, now.
That is the slow opening of the enzyme.

English: 
So, what happens when you take the magnesium out?
Remember what the single molecule FRET experiment showed us, that the opening is very slow.
But what happens to the chemical step?
Again, we see a burst, which is the phosphotransfer step followed by the slow opening.
Yes, the opening is very slow, but now you see that also the phosphotransfer, that burst...
that first burst is also very slow.
So, what we have learned is actually a very amazing thing, what nature does.
First of all, I can tell you why you have to eat magnesium.
I don't know what bio-transformed magnesium means -- you figure that out.
But what we have learned is that nature is that efficient or clever that it uses a
single atom to catalyze every essential step in this entire reaction.
Think about... one single atom is doing this entire job.
It can only do it when it's bound to the enzyme.

Portuguese: 
Então, o que acontece quando você retira o magnésio?
Lembre-se do que o experimento FRET de molécula única nos mostrou, que a abertura é muito lenta.
Mas o que acontece com a etapa química?
Novamente, vemos uma explosão, que é a etapa da fosfotransferência seguida pela abertura lenta.
Sim, a abertura é muito lenta, mas agora você vê que a fosfotransferência também, esse estouro ...
Aquele primeiro estouro também é muito lento.
Então, o que aprendemos é  uma coisa muito surpreendente, que a natureza faz.
Antes de tudo, posso dizer por que você precisa comer magnésio.
Não sei o que significa magnésio bio-transformado - você descobre isso.
Mas o que aprendemos é que a natureza é tão eficiente ou inteligente que usa um
único átomo para catalisar todas as etapas essenciais de toda essa reação.
Pense em ... um único átomo está fazendo todo esse trabalho.
Só pode fazê-lo quando está ligado à enzima.

English: 
It accelerates the phosphotransfer step by more than five orders of magnitude
relative to the uncatalyzed rate.
But at the same time, it's the same magnesium which catalyzes the conformational change
by three orders of magnitude.
So, I would call it moonlighting of a single atom in an enzyme.
You, being curious, may ask the question, how can a single atom do that?
And for this we sort of tried to do a couple of clever experiments.
So, the first thing we did is we replaced the magnesium with other divalent cations.
And what we learned is, by doing enzyme kinetic experiments, that the rate of chemistry is
significantly slower for all the other divalent cations... cations.
So, nature has optimized the chemical step, really, for magnesium.
In contrast, the conformational change, which was our new surprise, that it's also essential
for this reaction, is actually independent on which divalent metal you use, which means

Portuguese: 
Isso acelera o passo da fosfotransferência em mais de cinco ordens de magnitude
em relação à taxa não catalizada.
Mas, ao mesmo tempo, é o mesmo magnésio que catalisa a mudança conformacional
por três ordens de magnitude.
Então, eu chamaria isso de um átomo multitarefas em uma enzima.
Você,  sendo curioso, pode fazer a pergunta: como um único átomo pode fazer isso?
E para entender isso tentamos fazer algumas experiências engenhosas.
Então, a primeira coisa que fizemos foi substituir o magnésio por outros cátions divalentes.
E o que aprendemos é, fazendo experimentos com cinética enzimática, é que a taxa química é
significativamente mais lenta para todos os outros cátions divalentes ... cátions.
Então, a natureza otimizou a etapa química, realmente, para o magnésio.
Por outro lado, a mudança conformacional, que foi nossa descoberta, que também é essencial
para esta reação, mas é  independente de qual metal divalente você usa, o que significa

Portuguese: 
parece ser apenas puro efeito eletrostático.
Então, esses são dados de RMN coletados em diferentes ... com diferentes metais no sítio ativo.
O que me leva ao próximo método, que você deseja saber sobre o uso ... Para dinâmica de proteínas,
que são métodos computacionais.
Claro, no computador, você pode calcular tudo.
Então, a primeira coisa que vou mostrar é o cálculo do potencial eletrostático
no sítio ativo.
Você pode ver nossas duas moléculas de ADP, aqui e ali.
Você vê nossas argininas descendo.
As argininas, como você sabe, são carregadas positivamente, interagindo com os fosfatos carregados negativamente.
Eu disse que precisamos disso para a química, para movimentar o fosfato.
Mas, no final, essas interações precisam ser interrompidas para abrir a enzima para
liberar o substrato.
E lembre-se, esse é o nosso passo limitante.
Interações de carga muito fortes são muito, muito difíceis de quebrar.
Então, o que a natureza está fazendo?

English: 
it seems to be just a pure electrostatic effect.
So, these are NMR data collected at different... with different metals in the active site.
Which brings me to the next method, which you do want to know about using... for protein
dynamics, which are computational methods.
Of course, in the computer, you can calculate everything.
So, the first thing I'm going to show you is the calculation of the electrostatic potential
in the active site.
You can see our two ADP molecules, over here and over there.
You see our arginines coming down.
Arginines, as you know, are positively charged, interacting with the negatively charged phosphates.
I told you we need that for chemistry, to move the phosphate around.
But, at the end of the day, these interactions need to be broken to open up the enzyme to
release the substrate.
And remember, that's our rate-limiting step.
Very strong charge interactions are very, very hard to break.
So, what is nature doing?

English: 
It's putting another positively charged magnesium on the opposite side of them... of this interaction,
thereby weakening the electrostatic interactions.
A very clever mechanism.
What else can we do with computational methods?
One of the most famous things, of course, you've all heard about is
molecular dynamic simulations,
where we can finally get these dancing... dancing proteins, which looks very...
very... very interesting.
What is actually the derived... the physics behind it?
All we are going to do is calculate the laws...
Newton's laws of motion between the atoms.
So, it's a classical description of the system.
And so what I show you over here is actually the opening and closing of the enzyme,
that rate-limiting step.
There's one other thing I want to mention over there.
We can also visualize, in the computer, single water molecules, which of course we
cannot do in an experiment.
And that answered to me a very puzzling question.

Portuguese: 
Está colocando outro magnésio com carga positiva no lado oposto deles ... dessa interação,
enfraquecendo assim as interações eletrostáticas.
Um mecanismo muito inteligente.
O que mais podemos fazer com métodos computacionais?
Uma das coisas mais famosas, é claro, que você já ouviu falar é
simulações de dinâmicas molecular,
onde podemos finalmente conseguir essas proteínas ... dançando, o que parece muito ...
muito ... muito interessante.
Como é gerado... Qual a física por trás disso?
Tudo o que vamos fazer é calcular as leis ...
As leis de Newton de movimento entre os átomos.
Portanto, é uma descrição clássica do sistema.
E o que eu mostro aqui é na verdade a abertura e o fechamento da enzima,
nessa etapa limitante.
Há uma outra coisa que quero mencionar.
Também podemos visualizar, no computador, moléculas únicas de água, que é claro que
não pode ser feito em um experimento.
E foi que respondeu a uma pergunta muito intrigante.

Portuguese: 
Minha pergunta foi: como essa enzima pode efetivamente fazer a fosfotransferência, mas
evitar a hidrólise, que é a reação energeticamente favorável?
E se você pensa em enzimas, o mais difícil é suprimir
reações energeticamente favoráveis, em vez de catalisar a reação que você deseja.
E a reação mais favorecida é de longe a hidrólise.
Eu disse que se hidrolisarmos nosso ATP estaremos mortos em um minuto.
Portanto, essa enzima deve ser extremamente boa para suprimir a hidrólise.
Eu pensei que o que vai acontecer é que ele vai tirar todas as moléculas de água
do sítio ativo.
Mas não é isso que acontece.
Todas essas bolinhas aqui, são todas moléculas de água bem na cavidade de
no sítio ativo.
Como evitar a hidrólise?
Na verdade, as moléculas de água são mantidas longe o suficiente do fosfato para que
para que elas não possam sofrer hidrólise.

English: 
My question really has been, how can this enzyme efficiently do phosphotransfer but
avoid hydrolysis, which is the energetically favorable reaction?
And it turns out, if you think about enzymes, the hardest thing is actually to suppress
energetically favorable reactions, and not to catalyze the reaction you want to.
And the favored reaction by far is hydrolysis.
I told you if we hydrolyze our ATP we will be dead in a minute.
So, this enzyme has to be extremely good at suppressing hydrolysis.
I thought what's going to happen is that it's going to strip out all the waters
from the active site.
But that's not what happens.
All these little balls over here, these are all water molecules right in the cavity of
the active site.
How is it avoiding hydrolysis?
It's actually keeping the water molecules far enough away from the phosphate that
it cannot do hydrolysis.

Portuguese: 
E, finalmente, usando cálculos da mecânica quântica, podemos observar diretamente esse passo da fosfotransferência,
observar ... você está quebrando, por aqui, a ligação fosfato e a colocando ali.
É claro que precisamos de cálculos de mecânica quântica, porque precisamos quebrar as ligações.
Então, isso é apenas uma amostra do tipo de perguntas que você pode responder
com métodos computacionais.
Claramente, os métodos de computação precisam ser combinados com experimentos.
Voltando, o que estamos mostrando aqui é como combinar uma matriz realmente complementar
uma matriz realmente complementar de métodos biofísicos, que nos permite ... onde podemos descobrir
em uma superfície de energia livre, como essa enzima funciona.
E como está fazendo seu incrível poder de catálise.
No final, quero realmente chegar a algo que foi muito surpreendente.
As pessoas pensavam que se você pegar essas enzimas e elas não interagirem com um substrato, elas estão
basicamente inativas , eles estão dormindo ... o que não é verdade.

English: 
And finally, using quantum mechanical calculations, we can directly watch that phosphotransfer
step, watch... you're breaking, over here, the phosphate bond, and you put it over there.
Of course, we need quantum mechanical calculations there because we have to break bonds.
So, this is just giving you just a, really, flavor of what kind of questions you can answer
with computational methods.
Clearly, computation methods need to be combined with experiments.
Coming back, what we're showing you here is how combining an array, a really complementary
array of biophysical methods, where we're allowed... where we're able to figure out
on a free energy landscape how this enzyme works.
And how it's doing its amazing power of catalysis.
At the end, I want to actually come to something which was very surprising.
People thought that if you take these enzymes and they don't see a substrate they are
basically resting, they are asleep... which is not true.

Portuguese: 
Se você observar, na verdade, essa enzima no estado adormecido, mesmo na ausencia de substrato
ligado, há muito movimento acontecendo.
E, de fato, os movimentos já estão imitando o que a enzima precisa fazer durante a catálise.
Então, o que estamos dizendo é que a personalidade dinâmica é intrínsica ... é intrínsica
da enzima e está subjacente à catálise.
Então, deixe-me mostrar rapidamente como vimos que os movimentos que são de vital importância
para a catálise são realmente uma propriedade intrínseca da enzima.
Bem ali, eu mostro em vermelho, laranja e amarelo três estruturas desta ...
adenilato-quinase, desta quinase, no estado de repouso, o que significa que não há substrato ligado.
O que você pode ver é que as tampas já estão fechando parcialmente.
Então, o que tínhamos eram três moléculas na unidade assimétrica, e elas tinham estruturas diferentes.
E elas se moveram exatamente na trajetória para onde vão durante a catálise,
que é a estrutura verde.

English: 
If you look, actually, at this enzyme in the asleep state, meaning that there's no substrate
bound, there's a lot of motion going on.
And in fact, the motions are already mimicking what the enzyme needs to do during catalysis.
So, what we are calling it is like that the dynamic personality is built... it's built
into the enzyme and it underlies catalysis.
So, let me just quickly show you how we actually saw that the motions which are vitally important
for catalysis are really an intrinsic property of the enzyme.
Over there, I show you in red, orange, and yellow three structures which from this one...
from adenylate kinase, from this kinase, in the resting state, meaning there's no substrate bound.
What you can see is that the lids are already partially closing.
So, what we had were three molecules in the asymmetric unit cell, and they had different structures.
And they moved exactly along the trajectory where it should go during catalysis,
which is the green structure.

English: 
So, there's a partial closure already, directly along the direction where it wants to go
during catalysis.
So, the question is, of course, crystallography gets us snapshots but not timescales.
That's why the used molecular dynamics simulations to ask the question, what is the timescale
of this kind of motion?
And it turns out these partial lid closures happens in the nanosecond timescale.
All good... except we did one too many experiments.
We actually now looked at this free enzyme by NMR spectroscopy I just showed you.
And what we found there was that there's motion on the millisecond timescale.
That's orders of magnitude slower.
So, what are we missing?
So, again, our single molecule FRET experiments answered that question, because what we
could see... that, in real time, the enzyme indeed is doing a full closure but it is much slower.
So, in other words, you have a picture where you have fast timescale partial closure,

Portuguese: 
Então, já existe um fechamento parcial, diretamente na direção em que ela deve ir
durante a catálise.
Então, a questão é, claro, a cristalografia nos dá imagens instantâneas, mas não numa escala temporal.
É por isso que usamos simulações de dinâmica molecular para fazer a pergunta, qual é a escala de tempo
desse tipo de movimento?
E acontece que esses fechamentos parciais de tampa acontecem na escala de tempo de nanossegundos.
Tudo bem ... exceto que fizemos muitas experiências.
Na verdade, agora analisamos essa enzima por espectroscopia de RMN que acabei de mostrar.
E o que descobrimos foi que há movimento na escala de tempo de milissegundos.
São ordens de magnitude mais lentas.
Então, o que estamos perdendo?
Então, novamente, nossos experimentos FRET de molécula única responderam a essa pergunta, porque o que nós
podíamos ver ... que, em tempo real, a enzima está fechando completamente, mas é muito mais lenta.
Portanto, em outras palavras, você tem uma imagem em que você tem fechamento parcial na escala de tempo rápida,

English: 
and then a rare event, which is much slower, of full closure.
Which brings me to this... to the... to the beginning of my talk, to talk about the
hierarchy in space and time.
What do I mean, the hierarchy in space in time?
We want to link the slow motions, over here, to the fast motions.
And they're in fact linked, okay?
So, I told you a lot about experiments to look at how we go over the big mountain, right?,
the slow motions.
But how about measuring these fast motions, here?
For this, we can measure how fast a bond vector, shown over here, an amide bond vector,
is actually wiggling.
And not only do we get the timescale but we also get the amplitude.
So, we have measured those by NMR, again, that's now pico to nanoseconds, going down
to these faster motions.
And I show you those data as a continuous color scale, blue meaning that it's a very

Portuguese: 
e, em seguida, um evento raro, que é muito mais lento, de fechamento total.
O que me leva ... ao ... ao início da minha palestra, para falar sobre a
hierarquia no espaço e no tempo.
O que quero dizer com hierarquia no espaço no tempo?
Queremos vincular os movimentos lentos, por aqui, aos movimentos rápidos.
E eles estão de fato ligados, ok?
Então, eu falei muito sobre experimentos para ver como atravessamos a grande montanha, certo ?
os movimentos lentos.
Mas e quanto a medir esses movimentos rápidos, aqui?
Para isso, podemos medir a rapidez com que um vetor de ligação, mostrado aqui, um vetor de ligação amida,
está realmente se mexendo.
E não apenas obtemos a escala de tempo, mas também a amplitude.
Então, nós medimos esses por RMN, novamente, agora é de pico para nanossegundos, acelerando
para esses movimentos mais rápidos.
E eu mostro esses dados em uma escala de cores contínua, azul, o que significa que é muito

English: 
small amplitude -- so 1 would mean there's no... no amplitude change and 0 would be
a completely isotropic motion.
So, what you see is that there are hotspots, dynamic hotspots.
The red ones, right?
So, one more thing I want to explain to you, on the left side I have data on a mesophilic protein,
which had... which lives on... in normal, happy environments, and on the right side
is actually a hyperthermophilic enzyme, which actually lives in nature
in the hot vents.
So, what happens to these dynamic hotspots, here?
It turns out these are my elbows.
These are the hinges which need to be flexible so that that my lid can move.
So, what we see is fast timescale motions in my... in my elbow, so that, actually,
my hand can move.
So, fast timescale motions lead to slow timescale motions.
Interestingly, this is directly linked to activity.
Because if you look at the mesophilic and thermophilic enzymes, well, we know that thermophilic

Portuguese: 
pequena amplitude - então 1 significaria que não há ... nenhuma alteração de amplitude e 0 seria
um movimento completamente isotrópico.
Então, o que você vê é que há hot-spots, pontos de dinâmica mais intensa.
Os vermelhos, certo?
Então, mais uma coisa que quero lhe explicar, no lado esquerdo eu tenho dados sobre uma proteína mesofílica,
que tinha ... que vive ... em ambientes normais e felizes, e no lado direito
é uma enzima hipertermofílica, que na natureza
vive nos respiradouros quentes.
Então, o que acontece com esses hotspots dinâmicos aqui?
Acontece que estes são meus cotovelos.
Essas são as dobradiças que precisam ser flexíveis para que minha tampa possa se mover.
Então, o que vemos são movimentos rápidos na escala de tempo no meu ... no meu cotovelo, para que, na verdade,
minha mão pode se mover.
Portanto, movimentos rápidos na escala de tempo levam a movimentos lentos na escala de tempo.
Curiosamente, isso está diretamente vinculado à atividade.
Porque se você olhar para as enzimas mesofílicas e termofílicas, bem, sabemos que as enzimas termofílicas

Portuguese: 
em baixas temperaturas, a 20 graus, são muito pouco eficientes.
E a razão pela qual elas são lentas é porque há movimentos rápidos na escala de tempo em suas dobradiças,
eles ainda não estão vermelhos e amarelos.
Eles não têm grandes amplitudes.
Mas veja o que acontece quando você atinge uma temperatura em que, agora, as atividades são equivalentes.
As atividades daqui e daqui são equivalentes.
E a dinâmica também está no meu cotovelo.
Portanto, isso nos permite agora organizar, juntos, essa hierarquia no espaço de tempo
com movimentos rápidos na escala de tempo,mais localizados,
levando a movimentos mais lentos de mudanças mais globais.
Obviamente, conhecendo as estruturas, podemos fazer a pergunta: o que determina a
a diferença de flexibilidade nessas dobradiças?
E só estou mencionando duas coisas.
Uma é o conteúdo aromático - nós rigidificamos as termófilas empacotando muitos amino ácidos aromáticos
juntos e, portanto, mantendo-os rigidamente juntos.

English: 
enzymes at low temperatures, at 20 degrees, are very lousy.
And the reason why they are slow is because they're fast timescale motions in their hinges,
they are not red and yellow yet.
They have no large amplitudes.
But see what happens when you go to a temperature where, now, the activities are matched.
The activities from here and here are matched.
And so are the dynamics in my elbow.
So, that allows us now to put down, together, this hierarchy in space of time of fast timescale
motions, more localized, leading to slower motions of more global changes.
Of course, knowing the structures, we can ask the question, what dictates the differential
flexibility in these hinges?
And I'm just mentioning two things.
One is aromatic packing -- we rigidify the thermophile by packing a lot of aromatics
together and therefore rigidly holding it together.

English: 
And the second trick nature uses are prolines, because prolines, as you know, are imides
and restrict the backbone.
To summarize what I would like you to take home, I hope I have stimulated your appetite
to be intrigued about protein dynamics.
Coming back to the... to the beginning, there is no life without dynamics.
And of course what is moving are structural ensembles.
So, whether it's signaling, membrane transport, neurobiology, drug binding, what we
need to do is figure out the free energy landscapes of the systems to understand how the healthy,
happy proteins in our body work.
And then to finally apply that to do rational drug design to intervene with diseases,
which will be the second part of my lecture series.

Portuguese: 
E o segundo truque que a natureza usa são prolinas, porque prolinas, como você sabe, são imidas
e restringem o esqueleto.
Para resumir o que eu gostaria que você guarde, e espero ter estimulado sua curiosidade
e tenha ficado intrigado com a dinâmica das proteínas.
Voltando ao ... ao começo, não há vida sem dinâmica.
E é claro que o que está se movendo são arranjos estruturais.
Então, seja sinalização, transporte de membrana, neurobiologia, ligação a medicamentos, o que
O que você precisa fazer é descobrir as superfícies de energia livre
dos sistemas para entender como as proteínas saudáveis,
proteínas felizes funcionam em nosso corpo.
E, finalmente, para aplicar isso ao design racional de medicamentos para intervir em doenças,
que será a segunda parte da minha série de palestras.

English: 
The most importance slide is of course my team.
I am standing you here giving you the story, but in fact these are the guys who did
all the work.
My amazing team at Brandeis.
And I must say, they are the reason why I love to go to work every morning.
Thank you.

Portuguese: 
O slide de maior importância é, obviamente, minha equipe.
Estou aqui contando a história, mas, na verdade, esses são os caras que fizeram
todo o trabalho.
Minha equipe incrível na Brandeis.
E devo dizer que eles são a razão pela qual eu amo ir trabalhar todas as manhãs.
Obrigada.
